Съдържание
ANA имуноблотът е лабораторно имунологично изследване, което открива специфични автоантитела, насочени срещу различни ядрени, цитоплазмени и свързани с клетъчните структури антигени. То се използва основно при съмнение за системни автоимунни ревматични заболявания, известни още като системни заболявания на съединителната тъкан или колагенози. Такива заболявания са Системният лупус еритематозус, Синдромът на Сьогрен, системната склероза, смесената съединителнотъканна болест, дерматомиозитът, полимиозитът, антисинтетазният синдром и различни overlap синдроми. Терминът ANA означава антинуклеарни антитела. Буквално това са антитела срещу структури в клетъчното ядро. В съвременната имунология обаче се приема, че понятието е по-широко, защото много от тестовете за ANA могат да открият не само антитела към ядрото, но и към цитоплазмата, нуклеолите, митотичното вретено и други клетъчни компоненти. Затова в специализираната литература все по-често се използва и терминът „антиклетъчни антитела“ или anti-cell antibodies, но в клиничната практика названието ANA остава най-познато. ANA имуноблотът не е просто тест „положителен или отрицателен“. Неговата основна стойност е, че показва към кой конкретен антиген са насочени автоантителата. Това е важно, защото различните автоантитела се свързват с различни заболявания, клинични прояви, органно засягане, прогноза и нужда от проследяване.
Антителата са белтъци, произвеждани от В-лимфоцитите и плазматичните клетки, които нормално участват в защитата на организма срещу инфекции. При автоимунните заболявания имунната система губи част от своята толерантност към собствените тъкани и започва да образува автоантитела – антитела, насочени срещу собствени молекули. Антинуклеарните антитела са голяма и хетерогенна група автоантитела. Те могат да бъдат насочени срещу двойноверижна ДНК, хистони, нуклеозоми, рибонуклеопротеини, Ro/SSA, La/SSB, Sm, U1-RNP, топоизомераза I, центромерни белтъци, PM/Scl комплекс, Jo-1 и други антигени. Някои от тях имат висока диагностична специфичност, други са по-неспецифични и могат да се срещнат при различни автоимунни и неавтоимунни състояния. Важно е да се подчертае, че положителният ANA резултат не означава автоматично наличие на автоимунно заболяване. ANA могат да се открият при здрави хора, особено при нисък титър, при по-възрастни пациенти, след инфекции, при някои медикаменти, при автоимунни тиреоидни заболявания, чернодробни заболявания, неоплазии и други състояния. Затова лабораторният резултат винаги трябва да се тълкува заедно с клиничната картина.
В класическия подход първата стъпка при съмнение за системно автоимунно ревматично заболяване е скринингово изследване за ANA, най-често чрез индиректна имунофлуоресценция върху HEp-2 клетки. Този метод е чувствителен и дава информация не само дали има ANA, но и какъв е титърът и моделът на флуоресценция – хомогенен, гранулиран, нуклеоларен, центромерен, цитоплазмен, DFS и други. Когато ANA е положителен и клиничната картина насочва към автоимунно съединителнотъканно заболяване, следващата стъпка е уточняване на специфичните автоантитела. Тук се включва ANA имуноблотът. Той може да покаже дали пациентът има антитела срещу Sm, dsDNA, SSA/Ro, SSB/La, Scl-70, CENP-B, Jo-1, PM/Scl, U1-RNP, нуклеозоми, хистони, рибозомен P-протеин, AMA-M2, DFS70 и други. Практически може да се каже, че общият ANA отговаря на въпроса: „Има ли данни за автоантитела от ANA спектъра?“, докато ANA имуноблотът отговаря на по-конкретния въпрос: „Кои точно автоантитела са налице и към коя диагноза насочват?“ Въпреки това имуноблотът не трябва да се използва безразборно като скрининг при всяка неспецифична болка, умора или леко повишено СУЕ. Най-голяма диагностична стойност има, когато е назначен при реално клинично съмнение – например феномен на Рейно, фоточувствителност, типичен обрив, артрит, сика симптоми, мускулна слабост, интерстициална белодробна болест, склеродактилия, необясними цитопении, протеинурия, рецидивиращи серозити или други белези за системно автоимунно заболяване.
ANA имуноблотът е метод, при който отделни пречистени или рекомбинантни антигени са фиксирани като линии върху специална мембрана. Серумът на пациента се инкубира с тази мембрана. Ако в серума има антитела срещу някой от фиксираните антигени, те се свързват със съответната линия. След това чрез ензимна реакция и софтуерна оценка се отчита интензитетът на сигнала. Резултатите обикновено се представят като отрицателни, съмнителни, положителни или силно положителни. В някои лаборатории това се означава като 0, (+), +, ++ или +++. Това не е абсолютно количествено измерване като концентрация в международни единици, а по-скоро полуколичествена оценка на силата на реакцията. Силно положителният резултат обикновено има по-голяма клинична тежест от слабоположителния, но и тук има изключения. Например слабо положително антитяло при пациент без никакви симптоми може да бъде неспецифична находка, докато същото антитяло при пациент с типична клинична картина може да бъде важно диагностично потвърждение.
ANA имуноблот се назначава при съмнение за системно автоимунно заболяване, особено ако вече има положителен ANA скрининг или ако клиничните прояви са достатъчно убедителни. Изследването е подходящо при пациенти със ставни болки и обективен артрит, сутрешна скованост, необясними отоци на ставите, обриви по лицето или тялото, фоточувствителност, афти, косопад, феномен на Рейно, сухота в очите и устата, паротидно увеличение, мускулна слабост, повишена креатинкиназа, интерстициална белодробна болест, склеродактилия, телеангиектазии, дигитални язви, необяснима протеинурия, хематурия, цитопении, серозит, периферна невропатия и други системни прояви. Изследването може да бъде полезно и при вече поставена диагноза, когато се търси по-точна серологична характеристика на заболяването. Например при системна склероза автоантителата могат да помогнат за оценка на риска от интерстициална белодробна болест или белодробна артериална хипертония; при синдром на Сьогрен anti-SSA/Ro има класификационно и прогностично значение; при лупус anti-dsDNA, anti-Sm, нуклеозомни и други антитела могат да подпомогнат диагнозата и оценката на фенотипа.
За ANA имуноблот не е необходима специална подготовка. Изследването се извършва от венозна кръв. Пациентът не е задължително да бъде гладен, тъй като приемът на храна обичайно не влияе върху резултата. Въпреки това, ако едновременно се назначават и други лабораторни показатели, например кръвна захар, липиден профил или някои биохимични изследвания, лекарят или лабораторията може да препоръча вземане на кръв сутрин на гладно. Важно е пациентът да информира лекаря за приемани медикаменти, налични автоимунни заболявания, скорошни инфекции, бременност, онкологични заболявания и фамилна анамнеза за автоимунитет. Тези данни не винаги променят самото извършване на теста, но са важни за интерпретацията.
Anti-U1-RNP антителата са насочени срещу компоненти на малките ядрени рибонуклеопротеини. Те са класически свързани със смесена съединителнотъканна болест, известна още като синдром на Шарп. При високи титри и подходяща клинична картина – феномен на Рейно, оток на пръстите, артрит, миозит, езофагеална дисмотилност и белодробно засягане – те могат силно да подкрепят тази диагноза. Anti-U1-RNP могат да се срещнат и при системен лупус, системна склероза и overlap синдроми. Затова изолираното им наличие не е достатъчно за диагноза, но е важна насока за търсене на припокриващи се прояви.
Anti-Sm антителата са сред най-специфичните антитела за системен лупус еритематозус. Те не се откриват при всички пациенти със СЛЕ, тоест имат сравнително ниска чувствителност, но когато са положителни в подходящ клиничен контекст, имат висока диагностична стойност. Тези антитела могат да бъдат част от имунологичните критерии за лупус и са особено полезни при пациент с фоточувствителност, артрит, серозит, цитопении, бъбречно засягане или други типични прояви. Наличието им не означава автоматично тежка форма на заболяването, но подкрепя диагнозата СЛЕ.
Anti-SSA/Ro антителата са много важни в ревматологичната и имунологичната практика. Те се срещат при синдром на Сьогрен, системен лупус еритематозус, субакутен кожен лупус, неонатален лупус, някои форми на системна склероза, миозит и overlap синдроми. При синдром на Сьогрен anti-SSA/Ro са особено значими, защото се включват в съвременните класификационни критерии. При пациент със сухота в очите, сухота в устата, ксеростомия, кератоконюнктивит сика, увеличени слюнчени жлези, умора, артралгии или системни прояви положителните anti-SSA/Ro са силен аргумент за автоимунен процес. При бременни жени anti-SSA/Ro имат специално значение, защото могат да преминават през плацентата. В редки случаи те се асоциират с неонатален лупус и вроден AV-блок при плода. Затова при жени с известни anti-SSA/Ro антитела, особено при СЛЕ или синдром на Сьогрен, е необходимо акушерско и ревматологично проследяване.
Anti-Ro52 антителата са насочени срещу Ro52/TRIM21 антигена. В миналото често са разглеждани заедно с Ro60 като част от SSA системата, но в съвременната практика е важно да се прави разлика между Ro52 и Ro60. Anti-Ro52 могат да се открият при синдром на Сьогрен, системен лупус, системна склероза, идиопатични възпалителни миопатии, антисинтетазен синдром, интерстициална белодробна болест, автоимунни чернодробни заболявания и понякога при неревматични състояния. Изолираното Ro52 не е толкова специфично, колкото класическите заболяване-асоциирани антитела. В комбинация с други автоантитела обаче може да има прогностично значение. Например при миозитни и антисинтетазни фенотипове Ro52 често се обсъжда във връзка с по-изразен риск от интерстициална белодробна болест, макар че интерпретацията трябва да бъде индивидуализирана.
Anti-SSB/La антителата традиционно се свързват със синдром на Сьогрен и системен лупус. Най-голяма клинична стойност имат, когато се откриват заедно с anti-SSA/Ro. При такава комбинация вероятността за автоимунна екзокринопатия и системен автоимунен фенотип е по-висока. Съвременните данни показват, че изолираното anti-SSB/La, без anti-SSA/Ro, има по-ниска диагностична стойност и не трябва само по себе си да се приема като доказателство за синдром на Сьогрен. Това е важна промяна в интерпретацията, защото в миналото anti-SSB/La често се надценяваше като самостоятелен маркер.
Anti-Scl-70 антителата са насочени срещу ДНК топоизомераза I и са характерни за системна склероза. Те се асоциират по-често с дифузна кожна форма, по-бърза кожна прогресия и по-висок риск от интерстициална белодробна болест. При пациент с феномен на Рейно, склеродактилия, кожно уплътнение, дигитални язви, телеангиектазии, патологична капиляроскопия или диспнея, положителните anti-Scl-70 имат голямо значение. Те трябва да насочат към оценка за белодробно засягане чрез функционално изследване на дишането, DLCO и при показания високорезолюционна компютърна томография на бял дроб. Понякога anti-Scl-70 могат да бъдат фалшиво положителни в някои методи, особено при ниска клинична вероятност. Затова при неубедителна картина и слабоположителен резултат е разумно потвърждение с друг метод или повторна оценка от ревматолог.
Anti-CENP-B антителата са антицентромерни антитела, насочени срещу центромерни белтъци. Те са типично свързани с ограничена кожна форма на системна склероза и класическия CREST фенотип – калциноза, феномен на Рейно, езофагеална дисмотилност, склеродактилия и телеангиектазии. Тези антитела често се асоциират с по-бавна кожна прогресия в сравнение с anti-Scl-70 позитивната системна склероза, но могат да бъдат свързани с повишен риск от белодробна артериална хипертония в по-късен етап на заболяването. Затова пациентите с антицентромерни антитела се нуждаят от периодично проследяване, включително ехокардиография, DLCO и оценка за диспнея, синкоп, лесна умора и други белези за белодробна хипертония. Anti-CENP-B могат да се открият и при част от пациентите с първична билиарна холангитна болест, поради което при подходяща клинична и биохимична картина трябва да се оценят чернодробните показатели и AMA-M2.
Anti-PM/Scl антителата са свързани най-често с overlap синдром между системна склероза и възпалителна миопатия. Пациентите могат да имат едновременно феномен на Рейно, кожно уплътнение, артрит, мускулна слабост, повишена креатинкиназа, дисфагия и белодробно засягане. Тези антитела са важни, защото насочват лекаря да търси не само склеродермични прояви, но и миозит. При положителен PM/Scl често е уместно изследване на CK, LDH, AST, ALT, алдолаза, миозитен панел, електромиография, ЯМР на мускули или мускулна биопсия според клиничния случай.
Anti-Jo-1 антителата са най-известните антисинтетазни антитела. Те са насочени срещу хистидил-tRNA синтетаза и са свързани с антисинтетазен синдром, който може да включва миозит, интерстициална белодробна болест, артрит, феномен на Рейно, фебрилитет и характерни кожни промени по ръцете, известни като „mechanic’s hands“. Положителният anti-Jo-1 резултат е особено важен при пациент с необяснима диспнея, суха кашлица, интерстициални промени на образна диагностика, мускулна слабост или повишена CK. При някои пациенти белодробното засягане може да предхожда мускулните симптоми, което прави антитялото ценно за ранна насока към автоимунна интерстициална белодробна болест.
Anti-PCNA антителата са насочени срещу пролифериращ клетъчен ядрен антиген, участващ в репликацията и възстановяването на ДНК. Те се описват при малък процент пациенти със системен лупус еритематозус. Поради ниската си честота не са рутинен основен маркер, но когато са положителни в подходящ контекст, могат да подкрепят диагнозата СЛЕ. Тълкуването им трябва да бъде внимателно, защото самостоятелната им диагностична стойност е ограничена. Те са по-скоро допълващ елемент към цялостния автоантитялов профил.
Anti-dsDNA антителата са насочени срещу двойноверижна ДНК и са едни от най-важните антитела при системен лупус еритематозус. Те имат диагностична стойност и при част от пациентите корелират с активността на заболяването, особено с риска от лупусен нефрит. При положителен anti-dsDNA резултат трябва да се оценят клиничните прояви и допълнителните лабораторни показатели – C3, C4, урина, протеинурия, седимент, креатинин, eGFR, пълна кръвна картина и възпалителни маркери. Важно е да се знае, че различните методи за anti-dsDNA имат различна чувствителност и специфичност. При съмнение за лупусен нефрит или при несъответствие между клиника и резултат може да се използва потвърждаване с по-специфичен метод.
Антинуклеозомните антитела са насочени срещу комплексите от ДНК и хистони, които изграждат нуклеозомите. Те се свързват със системен лупус еритематозус и могат да бъдат полезни при диагностиката, особено в комбинация с anti-dsDNA, anti-Sm, нисък комплемент и типична клинична картина. При част от пациентите антинуклеозомните антитела могат да се асоциират с лупусна активност и бъбречно засягане, но не трябва да се използват изолирано за поставяне или изключване на диагнозата.
Антихистоновите антитела са класически свързани с лекарствено индуциран лупус. Те могат да се срещнат и при идиопатичен системен лупус еритематозус, но когато са силно положителни при пациент, приемащ медикаменти, известни с риск за лекарствен лупус, диагностичната им стойност нараства. Лекарствено индуцираният лупус обикновено протича с артралгии, миалгии, фебрилитет, серозит и положителни ANA, като тежко бъбречно и централно-нервно засягане са по-редки в сравнение с класическия СЛЕ. Интерпретацията изисква добра лекарствена анамнеза.
Антителата срещу рибозомен P-протеин се асоциират със системен лупус еритематозус. В литературата са обсъждани във връзка с невро-психиатрични прояви на лупус, лупусен хепатит и по-специфични клинични фенотипове, но тяхната интерпретация остава сложна. Положителният резултат може да подкрепи диагнозата СЛЕ, но не доказва самостоятелно наличие на невро-психиатричен лупус. При такива симптоми е необходима широка диференциална диагноза, включително инфекциозни, съдови, метаболитни, медикаментозни и психиатрични причини.
AMA-M2 антителата са насочени срещу митохондриални антигени и са най-характерни за първична билиарна холангитна болест. Включването им в някои ANA имуноблот панели е полезно, защото автоимунните ревматични заболявания могат да се припокриват с автоимунни чернодробни заболявания. При положителен AMA-M2 резултат трябва да се оценят чернодробните показатели, особено алкална фосфатаза, GGT, билирубин, AST, ALT, IgM, както и клинични симптоми като сърбеж, умора и холестатичен профил. При съмнение е необходима консултация с гастроентеролог или хепатолог.
Anti-DFS70 антителата са особен и много важен маркер в съвременната интерпретация на ANA. Те се свързват с т.нар. dense fine speckled модел при индиректна имунофлуоресценция. За разлика от много други ANA-асоциирани антитела, изолираното наличие на anti-DFS70, без други специфични автоантитела и без убедителна клинична картина, често се приема като маркер за ниска вероятност за системно автоимунно ревматично заболяване. Това не означава, че anti-DFS70 „изключва“ заболяване на 100%. Ако пациентът има типични клинични прояви, диагнозата не бива да се отхвърля само заради DFS70. Но при човек с положителен ANA, неспецифични оплаквания и изолиран DFS70 без други болест-специфични антитела, вероятността за СЛЕ, системна склероза, синдром на Сьогрен или миозит е по-ниска. Anti-DFS70 могат да се срещнат при здрави хора, при атопични заболявания, автоимунен тиреоидит, някои очни заболявания, дерматологични състояния и други неревматични процеси. Затова този маркер е полезен най-вече като част от алгоритъм за намаляване на свръхдиагностиката при случайно положителен ANA.
Положителният ANA имуноблот трябва да се тълкува на няколко нива. Първо се гледа кое антитяло е положително. Второ се оценява силата на позитивността – слаба, умерена или силна. Трето се преценява дали има съответстваща клинична картина. Четвърто се сравнява резултатът с ANA титъра и модела от имунофлуоресценцията. Пето се добавят други лабораторни и инструментални данни. Например anti-Sm при пациент с фоточувствителност, артрит, левкопения, нисък комплемент и протеинурия има съвсем различно значение от слабоположителен anti-Sm при човек без симптоми. Anti-Scl-70 при пациент със склеродактилия, феномен на Рейно и патологична капиляроскопия е силно насочващ, но слабоположителен Scl-70 без клинични белези трябва да се провери внимателно. Anti-DFS70 като единствена находка при безсимптомен пациент често има успокояващо значение, но DFS70 заедно с dsDNA, Sm или SSA вече не може да се разглежда като „изключващ“ маркер.
Отрицателният ANA имуноблот означава, че в конкретния панел не са открити антитела срещу изследваните антигени. Това намалява вероятността за някои системни автоимунни заболявания, но не ги изключва напълно. Причините са няколко. Първо, нито един панел не съдържа всички възможни автоантитела. Второ, някои заболявания могат да бъдат серонегативни или да имат антитела, които не са включени в конкретния имуноблот. Трето, резултатите зависят от метода и използваните антигени. Четвърто, в ранни стадии автоантителата могат да липсват или да са под прага на откриване. Затова при силно клинично съмнение отрицателният имуноблот не трябва автоматично да прекратява диагностиката. Може да се наложи повторна оценка, ANA чрез HEp-2 IIF, ENA с друг метод, anti-dsDNA с по-специфичен тест, миозитен панел, ANCA, комплемент, капиляроскопия, образни изследвания, биопсия или проследяване във времето.
ANA имуноблотът има няколко важни ограничения. Той е много полезен за уточняване на автоантитяловия профил, но не е самостоятелен диагностичен критерий. Може да има фалшиво положителни и фалшиво отрицателни резултати. Слабоположителните реакции трябва да се интерпретират внимателно. Различните производители и методи могат да имат различна чувствителност и специфичност за един и същ антиген.
Имуноблотът не замества клиничния преглед. Не замества и ANA имунофлуоресценцията, защото не дава пълна информация за титъра и модела на флуоресценция. Не е най-добрият метод за динамично проследяване на всички антитела. Например при СЛЕ активността по-често се проследява с клинична оценка, anti-dsDNA чрез подходящ количествен метод, C3, C4, урина и бъбречни показатели, а не само с повторен имуноблот. Не е правилно да се лекува „положителен имуноблот“ без диагноза. Лечението се определя от заболяването, органното засягане, активността, риска за пациента и съвременните терапевтични препоръки.
При системен лупус еритематозус ANA имуноблотът може да открие anti-Sm, anti-dsDNA, антинуклеозомни, антихистонови, anti-ribosomal P, SSA/Ro, SSB/La и други антитела. Anti-Sm е силно специфичен маркер, anti-dsDNA е важен за диагнозата и проследяването, особено при бъбречно засягане, а SSA/Ro има значение при кожни форми, синдром на Сьогрен overlap и бременност. Съвременният подход към СЛЕ е клинико-имунологичен. Диагнозата не се поставя само по ANA или имуноблот. Необходими са данни от анамнезата, обективния статус, лабораторните показатели, урината, комплемента, автоантителата и при нужда образни или хистологични изследвания. При съмнение за лупусен нефрит водещи са протеинурията, активният уринен седимент, бъбречната функция и бъбречната биопсия при показания.
При синдром на Сьогрен най-важни са anti-SSA/Ro антителата. Те имат класификационна стойност и се свързват с автоимунния характер на заболяването. Anti-SSB/La могат да допълнят профила, особено когато са заедно с SSA/Ro, но изолираното SSB/La има по-ниска диагностична стойност. При пациент със сухота в очите и устата положителните SSA/Ro подкрепят диагнозата, но не са единствен критерий. Необходимо е да се оценят обективни тестове за сухота, очно оцветяване, тест на Ширмер, слюнчен поток, ехография или биопсия на малки слюнчени жлези при показания. Синдромът на Сьогрен е системно заболяване и може да засегне стави, кожа, бял дроб, периферна нервна система, бъбреци и хематологичната система.
При системна склероза най-често се търсят anti-Scl-70, anti-CENP-B, anti-RNA polymerase III и други склеродермия-асоциирани антитела. В някои ANA имуноблот панели не всички от тях са включени, затова при силно съмнение може да е необходим разширен склеродермичен профил. Anti-Scl-70 насочва към по-висок риск от интерстициална белодробна болест, докато anti-CENP-B е по-често свързан с ограничена форма и риск от белодробна артериална хипертония. PM/Scl насочва към overlap с миозит. Тези антитела помагат не само за диагнозата, но и за планиране на проследяването – капиляроскопия, функционално изследване на дишането, DLCO, HRCT, ехокардиография, бъбречно проследяване и оценка на кожния статус.
При възпалителни миопатии ANA имуноблотът може да покаже Jo-1 и PM/Scl, но често е необходим отделен миозитен панел, който включва повече миозит-специфични и миозит-асоциирани антитела – например PL-7, PL-12, EJ, OJ, Mi-2, TIF1-gamma, MDA5, NXP2, SAE, SRP, HMGCR и други. Anti-Jo-1 е важен маркер за антисинтетазен синдром. Наличието му трябва да насочи към търсене на интерстициална белодробна болест, дори когато мускулната симптоматика не е изразена. Това е особено важно, защото белодробното засягане може да бъде водещият фактор за прогнозата.
Пациентът не трябва да се тревожи само заради положителен ANA или положителен отделен маркер. По-важно е дали има симптоми, какъв е титърът, кои антитела са положителни, колко силно са положителни и дали има обективни данни за възпалително или органно засягане.При положителен резултат е разумно пациентът да се консултира с ревматолог, особено ако има феномен на Рейно, ставни отоци, фоточувствителност, обрив, язви в устата, косопад, сухота в очите и устата, мускулна слабост, задух, протеинурия, хематурия, цитопении или необяснима температура. Ако резултатът е изолиран и пациентът няма симптоми, често е достатъчно клинично проследяване, без прибързано поставяне на диагноза.
ANA имуноблотът е ценно уточняващо изследване при съмнение за системни автоимунни ревматични заболявания. Неговото основно предимство е, че не само показва наличие на автоантитела, а определя конкретните им антигенни мишени. Това позволява по-прецизно насочване към диагнози като системен лупус еритематозус, синдром на Сьогрен, системна склероза, смесена съединителнотъканна болест, миозит, антисинтетазен синдром и overlap синдроми. В съвременната медицина обаче ANA имуноблотът не трябва да се тълкува изолирано. Най-правилният подход е съчетаване на клиничната картина, ANA титър и модел, специфичните автоантитела, допълнителни лабораторни показатели, образни изследвания и проследяване във времето. Положителният резултат може да бъде важен диагностичен ключ, но диагнозата винаги се поставя на пациента, а не на лабораторния лист.
Референции:
Аз съм лекар със специалност по Ревматология, започнал професионалния си път в клиниката по Ревматология към УМБАЛ „Свети Георги“ гр. Пловдив, където работя и към настоящия момент. Работя и в доболничната помощ в МЦ „Медикс Сърджъри“ гр. Карлово.
