Обща информация
Хемоглобинът е съществен елемент, необходим за основната физиологична функция на еритроцитите: транспорта на кислород и въглероден диоксид. Хемоглобинът е съдържащ желязо порфирин хромопротеин. Той се състои от две части – протеинова част – глобин, свързан с хем. Глобинът се различава по структура при различните хемоглобини, като създава специфичност на различните видове хемоглобин.
Α, β, γ и δ полипептидните вериги на глобина съставят физиологичните видове хемоглобин (всяка молекула хемоглобин съдържа две двойки полипептидни вериги), като α веригата е обща за трите вида хемоглобин:
HbA = α2 β2
HbA2 = α2 δ2
HbF = α2 γ2
Както при другите протеини, пространствената структура на хемоглобина и другите молекулни свойства зависят от вида и последователността на аминокиселините, които съставят хемоглобина. Заместването на аминокиселини в полипептидни вериги в резултат на генетични мутации генерира анормални варианти на хемоглобина, които имат различен електрически заряд и следователно различна електрофоретична подвижност. От друга страна, намаляването на скоростта на синтез на тип глобинова верига поражда количествени аномалии, наречени таласемични синдроми.
Електрофоретичният метод се използва рутинно при скрининг за аномалии на хемоглобина. Най-разпространения метод от тях е електрофорезата на Hb (хемоглобин) в алкална среда (рН 8,2-8,6), използваща агарозния гел като миграционна основа. При алкално рН хемоглобинът има отрицателен електрически заряд и мигрира към анода. По този метод физиологичните хемоглобини HbA, HBA2, HbF могат да бъдат отделени и идентифицирани и също така да мигрират серия от варианти на хемоглобин, като HbS, HbD, HbG, Hb Lepore, HbC, HbO-Arab, които показват повечето от известните хемоглобинопатии.
При изследване на всеки набор от проби се използва контрола, съдържаща хемоглобини A, F, S и C. Тъй като се използва протеиново оцветяване, а не такова за хем, карбоанхидразата (ензим с високо съдържание на еритроцити) ще бъде визуализирана допълнително в зад лентата А2. За да се идентифицират фракциите Hb, позицията на получените ленти се сравнява с тази на стандартните ленти, осигурени от контролния материал, (виж фиг. 1). Относителното количествено определяне на получените ленти се извършва чрез денситометрично сканиране на електрофоретичния гел.
Фиг. 1 Миграция на Hb фракции чрез електрофореза в агарозен гел при алкално рН
Въпреки това, електрофорезата на хемоглобин в агарозен гел при алкално рН има някои важни ограничения:
- големи вариации в количественото определяне на HbA2, което засяга правилната идентификация на заболяванията бета-таласемии
- невъзможността за разделяне на HbS от HbD и HbC от HbE и HbA2
Поради тези причини лабораторията понастоящем използва капилярна електрофореза за разделяне на Hb (хемоглобиновите) фракции. Чрез тази напълно автоматизирана техника, електрически заредените молекули се разделят въз основа на собствената им електрофоретична подвижност в алкален разтвор. Разделянето също се случва в зависимост от рН на електролитния разтвор и електроосмотичния поток.
Фиг. 2 Нормална Hb електрофореграма (при възрастни)
Фиг. 3 Нормална Hb електрофореграма (дете на 3 седмици)
Предимствата на използването на капилярна електрофореза са следните:
- по-добро количествено определяне на HbA2 за идентифициране на бета-таласемии (поради няколко едновременни анализа)
- диференциация на HbS от HbD, както и HbC от HbE и HbA2 (тези фракции съвместно мигрират при хемоглобинова електрофореза в агарозен гел в алкална среда
- тъй като карбоанхидразата не се визуализира на електрофореграмата, е възможно да се идентифицират вариантите на HbA2 в зоната Z1 (откриването на вариант на HbA2 е важно за правилната диагностика на бета-таласемиите, тъй като тя е нормална HbA2).
Цел на изследването
Целта на електрофорезата на хемоглобин е разделянето му на фракции. Това е важно за диагностиката на хемоглобинопатии и таласемични синдроми.
Кога да направя това изследване?
Провеждането на електрофореза на хемоглобина се препоръчва за диагностика на хемоглобинопатии и таласемични синдроми, за които има подозрение поради наличие на следните симптоми:
- хронична хемолитична анемия
- оклузивна съдова криза (запушване на кръвоносен съд) с неизвестна причина при пациент от области с повишени нива на Hb S и / или Hb C
- синдром на фетален хидропс (генерализиран оток на новороденото) с неизвестна причина
- внушителен външен вид на хемограмата, с по-тежка микроцитоза и хипохромия, отколкото би се очаквало за степента на анемия и брой на еритроцитите в горната граница на нормата или дори повишен, съдържаща голям брой таргетни (прицелни) еритроцити кръв. В тази ситуация за да се отдиференцира железния дефицит, са полезни индекса на Mentzer и RDW
Подготовка преди изследване
Не е необходима предварителна подготовка на пациента преди провеждане на изследването. То се провежда на гладно или след хранене.
Проба
венозна кръв
Метод
капилярна електрофореза. При всяко изследване на пробата се използва нормален HbA2 за контрола.
Референтни стойности
За трите физиологични фракции има вариации в зависимост от възрастта:
| Възраст |
Hb A% |
Hb F% |
Hb A2% |
| < 1 месец |
8.1 – 62.7 |
49.9 – 98.4 |
0.0 – 1.8 |
| 1 – 3 месеца |
37.3 – 88.8 |
10.3 – 64.6 |
0.3 – 2.4 |
| 3 – 6 месеца |
67.0 – 96.7 |
5.2 – 34.5 |
1.7 – 2.7 |
| 6 – 9 месеца |
82.4 – 98.8 |
1.1 – 28.5 |
2.0 – 3.0 |
| 9 – 15 месеца |
91.9 – 98.7 |
0.2 – 9.9 |
2.2 – 3.2 |
| 15 месеца – 2 години |
94.9 – 97.8 |
0.0 – 5.5 |
2.4 – 3.1 |
| 2- 6 години |
95.9 – 97.9 |
0.0 – 1.6 |
2.2 – 3.2 |
| 6 – 17 години |
96.4 – 98.2 |
0.0 – 0.0 |
1.9 – 3.3 |
| ≥ 18 години |
96.7 – 97.8 |
≤0.5 |
2.2 – 3.2 |
Интерпретация на резултатите:
- При леките форми на β- таласемия, стойностите на Hb A 2 се увеличават (3.2% – 7%), и Hb F леко се увеличава (0.5-6%) в над 50% от случаите, а останалата част е представена от Hb А (фиг .4)
- Фиг. 4 Електрофореграма на пациент с лека бета-таласемия
- При среднотежка β -таласемия процентът на Hb А 2 е променлив и Hb F е 20-80%
- При β -таласемия майор (тежка таласемия), стойностите на Hb F са много високи, обикновено между 20-90% от общия Hb, като останалата част се състои от Hb A (който е много ниски стойности) и HbA 2 (нормални или високи стойности). Клинично се характеризира с класическата картина на анемията на Кули.
- В допълнение към споменатите видове съществуват и други форми на β-таласемия с нормални стойности на Hb A 2 и Hb F („тиха“ таласемия) с нормални индекси на еритроцитите и „почти безсимптомна таласемия “ с модифицирани индекси на еритроцитите
- δβ-таласемията е резултат от делецията на δ и β гени, като същевременно се запазва целостта на γ гените, докато при A γδβ-таласемията се наблюдава делецията на A γ, δ и β гени, като се запазва целостта на G γ гена. Хетерозиготите представят хематологична картина, подобна на β-таласемия минор, но при хемоглобиновата електрофореза, процентът на Hb A2 има тенденция да намалява наполовина и Hb F постоянно се увеличава в пропорция 5-20%; хомозиготите показват фенотип, подобен на междинната β-таласемия, а електрофорезата показва Hb F в процент от почти 100%; генетичното изследване потвърждава диагнозата
- Hb Lepore е ненормален хемоглобин, при който α веригите са нормални, а не-α веригите имат структура, подобна на δ веригите в N-края и β веригите в C-края. Синдромът на Lepore, много наподобява клинично в своята хетерозиготна форма с β-таласемия минор, се характеризира с наличието на хемоглобин Lepore от 5-10%.
- Наследственото наличие на Hb F е клинично и хематологично безсимптомно, характеризиращо се с повишени стойности на Hb F, при хетерозиготи Hb F = 15-30%, а при хомозиготи може да достигне до 100% Hb F, независимо от всеки признак на болест
- При хетерозиготната форма на сърповидноклетъчна анемия, капилярната електрофореза показва необичайно Hb в Z5, Hb S, пропорционално на 25-45%, Hb A 2 присъства в нормално количество, а останалите фракции са представени с Hb А ( вижте фиг.5 ).
Повечето пациенти със сърповидно-клетъчна анемия са безсимптомни, с нормална или леко променена кръвна намазка (микроцитоза или „прицелни“ еритроцити). Едновременното наличие на Hb S с някои видове таласемии или други хемоглобинопатии променя клиничната и хематологичната картина, както и хемоглобиновата електрофореза.
Фиг.5 Електрофореграма на пациент с хетерозиготна форма на сърповидно-клетъчна болест
- При хомозиготната форма на сърповидно-клетъчна анемия, хемоглобиновата електрофореза показва наличието на Hb S пропорционално на 90-95%, а останалата част е представена от Hb A2 и Hb F. Хематологичната картина е нормална при раждането и започва да се променя след 6-месечна възраст, тъй като Hb F се заменя с Hb S
- Хемоглобинопатия С, при която хемоглобиновата електрофореза в агарозен гел и алкална среда, HbC се изолира като абнормна фракция, с много бавна миграция по линията Hb A 2, в същото положение с Hb E и Hb O Арабия се изолират в процент от 38-44%. За диференциацията на Hb C от Hb E и Hb O Arabia е необходимо да се извърши електрофореза при кисело рН (6-6,2). При капилярна електрофореза HbC се идентифицира отделно в Z2. Хомозиготите за Hb C (болест на хемоглобин С) имат следните характеристики: лека / умерена анемия с изразена микроцитоза (малки еритроцити), многобройни таргетни (прицелни) червени кръвни клетки в периферната кръвна намазка. При хемоглобинова електрофореза Hb C се изолира в количество от около 95%, като останалите са представени на Hb А2 и Hb F
Фиг. 6 Електрофореграма на хемоглобин от пациент с хетерозиготна форма на хемоглобинопатия С
- При лека α таласемия няма процентни промени на Hb A, Hb A 2 и Hb F, а хемоглобиновата електрофореза изглежда нормална при хетерозиготни индивиди, то двойните хетерозиготи развиват заболяване (Hb H болест) с клинично протичане на среднотежка таласемия. При хемоглобиновата електрофореза в агарозен гел при алкално рН може да се подчертае анормална фракция с бърза миграция (най-близка до анода), докато при капилярна електрофореза се открива анормална фракция в позиция Z15, съответстваща на Hb H ( 5-30%). Включвания на HbH (утайки от β вериги) могат да се наблюдават върху суправиталната цветна цитонамазка, при висок процент еритроцити (35-90%) с характерния външен вид на „топка за голф“. Молекулярната генетика обаче гарантира точната диагноза на всички форми на α – таласемия.
Фиг. 7 Електрофореграма на пациент с „Hb H болест“
Източници:
https://www.synevo.ro/shop/electroforeza-hemoglobinei/
