Диагноза на лаймската болест

Диагнозата на Лаймската болест (ЛБ) се базира на клиничните симптоми и риска от експозиция на пациента в област, където заболяването е ендемично. Лабораторните изследвания могат да осигурят потвърждение на диагнозата, но трябва внимателно да се интерпретират при липса на клинична корелация или епидемиологичен риск. Диагностиката на Лаймската борелиоза остава проблемна, което произтича от хетерогенността на причинителя, многоликата клинична симптоматика на заболяването, особеностите на имунния отговор на организма и диагностичните възможности на различните методи – директни и индиректни.

1. Директни методи

Лабораторните тестове за директно откриване на Borrelia burgdorferi имат ниска чувствителност. Доказването на борелиите с микроскопски, хистологични, молекулярно-генетични и културелни методи е затруднено поради малкия брой спирохети в телесните течности.

▪ Директна микроскопия

1. burgdorferi може да се визуализира в тъканни проби след оцветяване чрез сребърно импрегниране. При оцветяване тип сребърни петна (петна на Warthin-Starry), борелиите се наблюдават като светли, подвижни и спирално извити обекти на тъмен фон.

За визуализиране на B. burgdorferi могат да се използват поликлонални и моноклонални антитела, имунофлуоресценти методи, електронна фазовоконтрастна и микроскопия в тъмно зрително поле.

▪ Културелна диагностика

Способността за изолиране и култивиране на B. burgdorferi е от значение, поради факта, че културелната диагностика остава ꞌꞌзлатенꞌꞌ стандарт за потвърждаване на диагнозата. Borrelia burgdorferi е един от най-бавно растящите и размножаващи се микроорганизми. Твърде рядко се постига успех за изолирането на тази спирохета от телесни течности като кръв, лимфа, ликвор, урина или тъкани. Изолирането на причинителя от кожна биопсия на Еритема мигранс е с чувствителност от 40 до 60% и по-малко от 1% при изследване на синовиална течност.

▪ Polymerase chain reaction (PCR)

Въвеждането на PCR е важна стъпка в разширяването на диагностичните възможности по отношение на B. burgdorferi. Това е от особено значение в ранната фаза на заболяването, когато поради забавения имунен отговор, серологичните тестове често са негативни. PCR е с висока специфичност и с възможности за определяне вида на борелията или доказване на смесени инфекции между различните видове спирохети. Предвид недостатъчния брой борелии в клинични проби, молекулярните методи за диагностика се отличават с приблизително 60-80% чувствителност при кожна биопсия, докато при анализ на синовиална течност чувствителността варира от 46-88%. Положителният резултат от PCR, както и при другите тестове, трябва да се интерпретира в контекста на клиничната изява на заболяването. B. burgdorferi може да се докаже чрез молекулярните методи за диагностика в кожни биопсии, урина, кръв, ликвор и синовиална течност. Кръвта е неблагоприятна среда за борелиите и доказването им там е по-трудно и сравнително рядко. Молекулярните методи за диагностика са основна алтернатива на серологичното изследване в ранния стадий на заболяването, преди стартирането на етиологичната терапия.

I. Индиректни методи

Индиректните методи са отражение на имунния отговор на организма срещу B. burgdorferi.

▪ Серологични методи на изследване

Рутинната лабораторна диагностика на ЛБ е серологична и се базира главно на използването на широко достъпните в лабораторната практика серологични методи на изследване (ELISA, ELFA, CLIA, IFA). Потастоящем в лабораторната практика са налични напълно автоматизирани тестове за количествено определяне на специфични anti-Borrelia IgM и IgG антитела в серум и ликвор, базирани на ELISA и CLIA технологии.

Серологичните методи на изследване са най-полезни при пациенти с клинична симптоматика. Настоящите анализи не правят разлика между активна и неактивна инфекция, като болните могат да останат серопозитивни в продължение на години, включително с IgM отговор, дори след адекватно антибиотично лечение. По-голямата част от тестове за ЛБ, се основават на откриването на специфични IgM/IgG антитела срещу B. burgdorferi в серума. Трябва да се има предвид, че са различни щамовете Borrelia в САЩ (B. burgdorferi senso stricto) и Европа (B. garinii, B. afzelii, B burgdorferi senso stricto), но тестовете са предназначени да откриват всички видове Borrelia, които причиняват заболяването. Резултатите от серологичните изследвания следва да бъдат интерпретирани много внимателно, изхождайки от характерната динамика на антителния отговор и клиничната симптоматика. Отрицателният серологичен резултат не отхвърля категорично диагнозата. Специфични антитела според различните автори се откриват в 40-60% от болните, което зависи предимно от времето, изминало от началото на инфекцията, както и от дисеминирането й.

В началната фаза на инфекцията, поради забавения имунен отговор, серологичните тестове често могат да бъдат негативни (фалшиво отрицателни). Препоръчва се кръв за серологично изследване да се взема не по-рано от 25-ия ден. Ранното прилагане на антибиотична терапия може да потисне антитялообразуването и да забави превръщането на IgM отговора в IgG. Възможно е получаване на фалшиво положителни резултати, поради кръстосана реактивност с други антитела в серума при съпътстващи автоимунни заболявания, сифилис и някои вирусни инфекции (EBV). Ето защо положителен резултат от скринингов тест трябва да бъде потвърден с втори тест – имуноблот (Western Blot). Имуноблот методите обаче не са стандартизирани по отношение на използваните антигени, методика и интерпретация. Препоръките на повечето гайдлайни относно серодиагностиката на ЛБ включват прилагането на двустъпков подход (Фигура 1). Първата стъпка от диагностичният алгоритъм при ЛБ включва използването на скринингов тест – ензимен имуноанализ (ELISA), хемилуминесцентен имунен анализ (CLIA) или индиректен имунофлуоресцентен анализ (IFA). Ако полученият резултат от теста е отрицателен, не се препоръчва допълнително изследване. Наличието на неопределен или положителен резултат от скрининговия тест, налага потвърждаването му с помощта на имуноблот (Western blot),  като втора стъпка.

Фигура 1. Двустъпков подход в лабораторната диагностика на Лаймската болест

Имyнoблoтът e лaбopaтopeн тecт, ĸoйтo открива антитела ĸъм cпeцифични пpoтeини за В. burgdorferi и се визуализира с образуване на характерен банд (“лeнта“). Резултатите от различните имуноблот методи се интерпретират като положителни въз основа на наличието на определен вид бандове.

▪ Лимфоцитeн трансформационен тест

Лимфоцитният трансформационен тест (ЛТТ) се базира на принципа на антиген/алерген-специфично индуциране на клетъчното делене на лимфоцитите след контакт със съответния антиген. Позитивната реакция при ЛТТ открива антиген-специфични лимфоцити (паметови клетки, които вече са се срещали с дадения антиген) в кръвта на изследвания човек.

ЛТТ може да компенсира недостатъците на серологичната диагностика при Лаймска болест. Този тест се позитивира само при повишен брой на патоген-активирани лимфоцити (т.нар. Т1-хелперни ефекторни клетки) в кръвта. ЛТТ открива дали клетъчният имунитет в момента на изследването все още взаимодейства с В. burgdorferi, т.е. дали инфекцията е активна в конкретния момент. ЛТТ открива Т-лимфоцити, които имат ограничена продължителност на живот, за разлика от антителата, които може да се задържат дълго. Затова позитивният ЛТТ резултат отразява взаимодействие между имунната система и патогена през последните 4-6 седмици. Чрез ЛТТ се оценява специфичния клетъчен имунен отговор към B. burgdorferi, използващ лизатни антигени на Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii и Borrelia garinii и рекомбинантен OspC, чрез изследване на серонегативни и серопозитивни здрави индивиди, както и на серопозитивни пациенти с клинично проявена Лаймска борелиоза.

Индикациите за ЛТТ Borrelia burgdorferi включват:

• Клинично съмнение за Лаймска болест с неубедителни серологични резултати;
• Съмнение за персистиране на заболяването след антибиотично лечение;
• Проследяване на ефекта от проведеното лечение;
• Клинични прояви, насочващи към реактивиране на заболяването.

Въпреки, че серологичните тестове потвърждават инфекцията, те не могат да определят дали инфекцията е активна и следователно изисква лечение. Освен това, резултатите са отрицателни в ранната фаза на инфекцията; антителата  могат да са позитивни дълго време, въпреки ефективно лечение и не на последно място междулабораторни резултати могат да бъдат несъвместими.

Чувствителността на ЛТТ ​​при клинична борелиоза преди антибиотично лечение е определена като 89,4%, докато специфичността е 98,7%.

Интензитетът на LTT ​​реакцията се определя от индекса на стимулация (стойност SI):

• SI < 2       = липса на реактивност
• SI  2 – 3    = неясна реакция
• SI  5 – 10  = средна положителна реакция
• SI  10 – 20 = интензивна положителна реакция
• SI > 20      = силна положителна реакция, много вероятно е текущо излагане на имунната система на патогена.

Фактът, че след ефективно антибиотично лечение в повечето случаи ЛТТ става негативен или поне индексите на стимулация (SI) намаляват значително, е поредното доказателство в полза на тезата, че резултатите от ЛТТ наистина отразяват активността на инфекцията. Така тестът за Borrelia информира лекуващия лекар за ефективността на антибиотичното лечение при съответния пациент. Въпреки това отрицателния резултат от ЛТТ не изключва с абсолютна сигурност наличието на активна инфекция. Следователно оценката на клиничната картина трябва да бъде на първо място в диагностиката на ЛБ и назначаването на лечение.

Отрицателни резултати от ЛТТ се наблюдават:

• При лица, които никога не са се заразявали с B.
• При клинично здрави серопозитивни индивиди около 6-8 седмици след антибиотично лечение на активна ЛБ.

▪ Други диагностични методи

През последните години различни диагностични методи имат претенцията да диагностицират Лаймската борелиоза. Това включва Enzyme-linked immunospot assay (ELISPOT); Visual Contrast Sensitivity Test; CD57-позитивна/CD3 негативна лимфоцитна субпопулация; ксенодиагностика. Нито един от тези тестове не паказва научно обоснована валидация и не е приет при диагностицирането на ЛБ. Причините за това са: малкото добавена стойност в сравнение със серологичните методи и факта, че научните изследвания до момента показват различни резултати, но не дават достатъчно доказателства. Положителните резултати при този вид тестове може да се дължат на други основни заболявания или състояния, а не само инфекцията с B. burgdorferi.

Новост в диагностиката на ЛБ е Мultiplex phosphorescence immunoassay, при който става едновременно отриване на антитела към различни борелийни антигени – C6, OspC и VlsE. Някои автори твърдят, че това може да премахне необходимостта от двустепенно тестуване. Друг нов метод – Immuno-PCR (iPCR), откриващ антитела срещу B. burgdorferi в серум, комбинира чувствителността на PCR  и ELISA. Най-често се използва зa oтĸpивaнe нa xpoничнa инфeĸция, когато резултата от него e пoлoжитeлeн.